缩阴药

一例猪流感的RT-PCR诊断
文英会 ，崔保安 ，刘内生 ，陈红英
(1．西南民族大学生命科学与技术学院,增强抵抗力，成都 610041；2．河南农业大学牧医工程学院，郑州450002)
摘要：2007年11月，河南省鹤壁市某猪场发生一起疑似猪流感的疾病。根据猪流感NP基因序列设计、合成1对引物，应
用RT-PCR技术对病死猪的气管、肺脏等组织进行RT-PCR扩增，扩增出预期目的片段。结合临床症状和病理剖检变化确诊
为猪流感感染。
关键词：猪；流感病毒；RT-PCR；诊断
中图分类号：$858．286．3 文献标识码：B 文章编号：1671 7236(2009)01-0102-02
猪流感(swine influenza，SI)是由正黏病毒科的
猪流感病毒(swine influenza virus，SIV)引起的猪
的一种急性、高度接触性呼吸道传染病，为猪的免疫
抑制性疾病之一。临床上以突发高热、精神不振、咳
嗽、呼吸困难，发病率高、死亡率不高，迅速康复或死
亡为主要特征(Easterday等，1987)。不同日龄、性
别和品种的猪均可感染本病。单纯感染SIV的猪，
其病理变化主要表现为病毒性肺炎及其它呼吸器官
的炎性变化(杨焕良等，2007)。临床上猪常因继发
感染肺炎、支气管肺炎、胸膜炎、猪肺疫、猪繁殖与呼
吸综合征、链球菌病等而发生死亡，加重了SI对养
殖业的危害。猪流感目前尚无特效治疗药物，一旦
暴发流行将给养猪业造成很大的经济损失。
2007年11月，河南省鹤壁市某猪场发生一起
以突发高热，体温41℃ ，精神萎靡，食欲不振，咳嗽、
呼吸急促为主要特征的疾病，经RT-PCR检测猪流
感病毒阳性，结合临床症状、剖检变化确诊为猪
流感。
1 发病情况、临床症状及病理变化
该发病猪场存栏基础母猪200头，育肥猪500
收稿日期：2008 05-23
作者简介：文英会(1979一)，女，河南人，助理兽医师，硕士，研究
方向：分子免疫学和分子病毒学。
通信作者：崔保安。
基金项目：河南省杰出人才创新基金(06210021oo)。
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多头，育成猪和哺乳仔猪约2000头。2 O(]7年11月，
由于天气骤变，气温突降，受冷应激的影响，猪群突
然发病，病猪体温升高到41℃ ，食欲下降或废绝，精
神萎靡，呼吸急促，阵发性咳嗽，流鼻涕，大部分猪的
症状在3～4 d内逐渐消失，部分病猪死亡。共剖检
2头病死猪，肉眼病变主要表现为咽喉、气管、支气
管黏膜充血、肿胀，气管内有大量带泡沫状的黏液，
肺病变部呈红色，如鲜牛肉状，界限分明，周围组织
有气肿。颈淋巴结和纵膈淋巴结肿大、充血和水肿。
胃肠有卡他性炎症，十二指肠充血明显。根据临床
症状和病理剖检变化，怀疑为猪流感病毒感染。
2 实验室检验
采集病死猪的气管和肺脏组织，采用RT-PCR
方法检测。
2．1 引物的设计与合成根据GenBank发表的猪
流感病毒NP基因序列，设计合成1对特异性引物，
预计扩增片段为150 bp，引物序列为：上游引物P1，
5 一ACGGAAGTTATAAGGATGA一3 ；下游引物
P2，5 一TGTCTCCGAAGAAATAAGA一3。
2．2 检测样品的制备剖检病死猪2头，无菌采集
气管、肺脏组织后研磨，用生理盐水作5倍稀释，反
复冻融3次，4℃ 6000 r／rain离心10 min，收集上
清液，备用。
2．3 病毒基因组总RNA 提取 按照总RNA 提取
试剂盒的说明步骤进行。① 取上清液400 L，加人
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中国畜牧兽医 2009年第36卷第1期 疾病防治· lO3 ·
等体积Trizol，剧烈振荡混匀，直至液体清亮；
② 加入lO0 L氯仿／异戊醇(24：1)，剧烈振荡混
匀30 S，12000 r／min离心5 min；③ 将上清液(约
450 L)小心转到一个无菌的1．5 mL RNase-free
离心管里，加入15O L无水乙醇，混匀；④ 将上述溶
液全部转移到2 mL的收集管GenClean柱中，室温
放置2 min，8000 r／min离心1 min；⑤ 小心取出柱
子，弃去收集管中的废液，将柱子放回收集管中，
加入450 L RPE solution(已加4倍无水乙醇)，
10000 r／rain室温离心30 S；⑥ 重复步骤⑤ 1次，
12000 r／rain离心3 rain；⑦ 小心加入20 L DEPC-
H O于柱内膜中央，7O℃ 水浴3 min；⑧12000 r／
min室温离心1 min洗脱，直接反转录为cDNA或
一70℃ 贮存备用。
2．4 cDNA第一链的合成 用提取的病毒总RNA
进行反转录，反转录过程如下：①取11 L DEPC水
溶解的RNA，加入反转录引物(50~mol／L)1 L，
7O℃温浴10 min，快速置冰上5 rain，稍离心。②加
入5× Bufer 4 L，20 U／FL RNasin 1 L，10
mmol／L dNTP 2 L，稍离心，42℃ 温浴2 min。③
快速加入200 U／uL反转录酶1 L，混匀，42℃水
浴1 h，再70℃ 水浴15 min灭活反转录酶，立即置
冰上冷却，随后进行PCR扩增。
2．5 猪流感病毒NP基因的RT-PCR扩增PCR
反应体系为：模板eDNA 3 BL，Premix Taq 13 L，
SIV的上下游引物(50~mol／L)各0．5 L，用灭菌
的ddH zO补至25 L。反应程序为：94℃ 预变性5
rain；94℃ 变性30 S，50℃ 退火30 S，72℃ 延伸30
S，30个循环；72℃ 延伸10 rain。试验中用已知的
SIV作阳性对照，用不含SIV 的猪肺脏和气管混合
物作阴性对照，空白对照不加模板。反应完毕，取
PCR产物1O L，加入上样缓冲液，于混有溴化乙锭
(终浓度为1~g／mL)的3．0 琼脂糖凝胶上电泳检
测，紫外灯下观察。结果发现，待测样品可扩增得到
1条与阳性对照相符的150 bp的特异性条带，而阴
性对照和空白对照未出现特异性扩增条带(图1)，
同时结合临床症状和病理变化，确诊该病例为猪流
感病毒感染。
3 讨论和小结
近年来．随着猪呼吸道疾病流行的日趋严重，猪
流感病毒极易造成其他呼吸道疾病的继发感染，使
疫情变得更加复杂，增加死亡率。同时猪流感病毒
图1 猪流感病毒NP基因的PCR产物电泳结果
注：M，DNA Marker DL500；1，阳性对照；2，被检样品；3，阴性
对照；4，空白对照。
可传染给人，是禽流感病毒和人流感病毒的"放大
器"和重组体，具有非常突出的公共卫生学意义，其
传播流行不但对养殖业造成严重的经济损失，更严
重影响着人类的身心健康。
由于猪流感病毒的血清亚型众多，病毒的变异
性强，给临床诊断和防治带来了重重困难。常规的
病毒分离鉴定、琼脂扩散试验等检测手段费时费力，
而且敏感性不强，无法达到需要。RT-PCR反应以
其特异性强、灵敏度高和操作方便等优点，成为猪流
感诊断的主要方法，为猪流感的早期诊断和流行病
学调查奠定了理论基础。
由于NP基因是流感病毒8个基因片段中高
度保守的一个基因，在病毒的诊断方面具有重要
的意义。于康震等通过设计AIV NP基因的特异
性引物，建立了RT-PCR方法，可以直接从临床感
染组织中检测所有亚型的AIV。本研究将NP基
因作为PCR扩增的模板，能兼顾所有不同亚型毒
株之间的保守区段，对猪流感病毒的检测具有很
好的通用性。
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